在现代生物医学研究中，蛋白质的一级结构，即氨基酸序列，已不再被视为静态的分子符号。它不仅决定了蛋白质的空间构象和功能特性，更在深层次上影响细胞行为、信号通路动态，甚至涉及进化路径与疾病机制。因此，获取蛋白质的准确序列成为理解其生物学功能和作用机制的基础。与传统的“蛋白鉴定”不同，蛋白测序（Protein Sequencing）专注于完整且连续的氨基酸信息，主要用于解析未知蛋白、识别序列突变、确认药物蛋白的一致性，以及追踪翻译后修饰等关键科研任务。在生物药物开发、个体化医学、结构生物学和抗体工程等高精度领域，蛋白测序技术的精细化能力正日益成为研究和应用决策的重要技术杠杆。

一、蛋白测序与蛋白鉴定的区别

在蛋白质组学研究中，“测序”和“鉴定”等术语常被混用，导致误用和技术选择上的错误，甚至影响研究的假设。蛋白测序定义为氨基酸序列解析的过程，旨在重建其一级结构，通常表示为从N端到C端的完整或部分氨基酸序列。其目标在于获取“序列本体”，而非仅仅判断蛋白质的“存在性”或“类别”。相比之下，蛋白鉴定（Protein Identification）则依赖质谱与数据库的比对，确定某一肽段是否“属于”某个已知蛋白，是一种分类式的归属判断，而非逐位点的信息重建。

二、蛋白测序技术的演变

蛋白测序技术经历了多个阶段的演化：首先是Edman降解法，这是20世纪50年代Pehr Edman建立的化学解析技术，基于苯异硫氰酸（PITC）对N端氨基酸的特异性反应，通过顺序性标记与切除释放并鉴定每一轮循环的PTH-氨基酸，这一方法在蛋白质质量验证和重组蛋白的评估中仍具有独特优势。

接下来是Bottom-up质谱策略，这一策略通过特异性酶将蛋白质降解为短肽段，并通过LC-MS/MS进行检测，其高通量和适应性使其成为当前最常使用的蛋白测序方法。虽然这种方法有效，但由于缺乏序列上下文信息和修饰定位的限制，其在运行高度异构蛋白和融合蛋白时仍面临挑战。

然后是Top-down质谱策略，这种方法直接将完整蛋白质送入质谱系统，通过高能碎裂解析其多级碎片离子，提供了对一级结构的整分子解析。此技术特别适用于翻译后修饰（PTM）识别，以及生物药质量属性评估，但其对样本的纯度和稳定性要求极高。

最后，单分子蛋白测序（Single-Molecule Protein Sequencing, SMPS）技术的兴起，逐渐摆脱了酶解和片段信息依赖，能直接读取氨基酸顺序。不同于传统的方法，单分子测序技术不易受修饰丢失和链内关联缺失的限制，正在为蛋白质组学开辟新的研究方向。

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