2025年4月，湖南师范大学的杨荣华教授和邹振副教授带领的研究团队在《Nucleic Acids Research》（IF=167）上发表了文章，题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”。该研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a的单核苷酸变异（SNV）检测平台——HEPSD（高能量惩罚SNV检测平台）。该系统通过二元crRNA结构设计，有效激活Cas12a的切割活性，并利用非平衡杂交来调节放大单核苷酸错配信号。

HEPSD在高GC含量环境中对难以检测的SNV（包括摆动突变）表现出很好的区分能力，其对临床样本的识别准确度与定量PCR（qPCR）和下一代测序（NGS）高度一致，达到了100%的准确率。这一发现证明了HEPSD在临床分子诊断中的潜力，并且其设计原理可扩展至其他CRISPR系统。

研究背景

单核苷酸位点变异（SNVs）是常见的遗传变异形式，与多种严重疾病（如癌症、单基因疾病和传染病）密切相关。传统SNV检测方法（如TaqMan探针、分子信标、ARMS-PCR等）难以适用于某些SNV（如摆动碱基对和高GC含量区域）。CRISPR-Cas系统（如Cas12a）在核酸检测领域蕴含革命性潜力，但Cas12a在识别过程中的特异性仍存在不足，尤其是在检测摆动碱基对或高GC含量区域的SNV时，面临较大挑战。

研究结果

RNA/DNA二元探针与热力学分析

研究中采用的二元探针（BPs）由长臂和短臂两个杂交臂组成，专门设计用于通过选择性杂交区分SNVs。研究人员比较了线性探针（LPs）和二元探针（BPs），结果显示，BPs在更广泛的温度范围内（温差达40℃）均表现出良好的性能，并且保持较长的结合状态。

非平衡杂交驱动的高能量SNV检测系统

基于BPs辅助激活Cas12a的性能，研究人员设计了二元CRISPR RNA（crRNA）结构，结合Cas12a系统开发了HEPSD平台。分子动力学模拟与荧光各向异性分析表明，HEPSD在匹配目标中形成稳定的三元复合物，而错配目标则表现出动态不稳定性，从而抑制Cas12a的激活。实验结果证实，HEPSD在错配情况下只部分解旋DNA，避免了Cas12a的误激活，显著提高了SNV的识别选择性。

HEPSD对难检测SNV的高效区分能力

在完成HEPSD的开发后，该平台对SNV的检测性能进行了评估。HEPSD能够成功识别传统方法难以检测的SNV，包括高GC含量区域的突变以及形成摆动碱基对的错配，检测限最低可达0.01%的突变等位基因频率（VAF）。此外，HEPSD对完全匹配的目标保持高效切割活性，而对错配目标几乎无活性。

HEPSD分析BRAFV600E和EGFRL858R突变

为进一步评估HEPSD在临床癌症突变检测中的有效性，研究者选择了BRAFV600E和EGFRL858R作为目标突变。在104例BRAFV600E和28例EGFRL858R的临床样本中，HEPSD的敏感性与特异性均达到100%，且与qPCR和NGS结果高度一致，尤其在血浆样本中成功检测到低丰度突变，表现优于传统qPCR方法。ROC曲线分析显示，HEPSD的AUC值为1000，表明其具有卓越的诊断准确性。

结论与展望

本文介绍了一种基于二元间隔物辅助的CRISPR/Cas12a平台（HEPSD平台），通过创新设计的“二元crRNA架构”，引入非平衡杂交驱动调控机制，显著增强了错配碱基的能量差异，从而实现超高特异性识别。HEPSD在处理难以检测的SNV方面表现卓越，能够精准区分传统方法难以检出的错配类型。此外，HEPSD成功检测和鉴定了132个临床样本中的BRAFV600E或EGFRL858R变体，准确率为100%，这表明其在临床分子诊断中具有巨大的应用潜力。总的来说，HEPSD平台不仅实现了对SNV的高灵敏、高特异性检测，还为癌症早诊和个性化治疗提供了新的工具，其设计原理也有望拓展至其他CRISPR系统，未来或助力基因编辑的脱靶控制。

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参考文献：Liu Q, Jiang Z, Li S, Li Y, Wan Y, Hu Z, Ma S, Zou Z, Yang R. Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants. Nucleic Acids Res. 2025 Apr 10; 53(7): gkaf287. doi: 10.1093/nar/gkaf287